探究改良原位杂交技术在鼻咽肿瘤病理诊断中的

0 引言

人体鼻咽部处于软腭上、鼻腔后的咽腔，具有部位隐蔽、构成复杂的特征，受EB 病毒感染、饮食习惯、环境因素等影响，鼻咽癌多发于此部位。EBER 显色原位杂交技术（CISH）可定位，用此方式检查，可确定细胞、组织与病毒间的关系，目前，医学界公认的标准方式之一则为EBER 原位杂交方式。常规EBER 原位杂交检测方式操作复杂，杂交时间较长，易导致检验过程和结果不稳定或误差[1]，影响疾病预后和治疗。经医学界各医学者对常规EBER 原位杂交检测方式改良优化后，已取得了一定认可和地位。为此，本研究共纳入90 例鼻咽部疾病患者重点讨论改良EBER 原位杂交技术诊断鼻咽肿瘤病理的作用，具体报告如下。

1 资料及方法

1.1 一般资料

随机从我院2016 年5 月至2018 年8 月收治的鼻咽疾病患者中抽取90 例进行讨论，患者均接受鼻咽部病理组织活检，用中性甲醛溶液10%固定后，石蜡包埋切片后染色，厚度≤3μm，根据WHO 组织制定的淋巴瘤分类诊断标准，用免疫组织化学标记物进行检测，确诊90 例患者：鼻咽黏膜慢性炎或合并良性淋巴组织增生（NBLA）共21 例，未分化型非角化性鼻咽癌（NPC）共32 例，弥漫性大B 细胞淋巴瘤（DLBCL）共22 例，结外NK/T 鼻型淋巴瘤（ENKL）共15 例。排出已接受放化疗治疗者。90 例鼻咽疾病患者中包含男性59 例，女性31 例，年龄13～67 岁，平均（45.）岁。各患者各项资料均满足本研究要求和标准。

1.2 方法

试剂：ZLI-9013 胃酶工作液、ISH-5022-S 型EBER 原位杂交试剂盒、S500-24 型原位杂交仪。

改良检测步骤：连续切片2～3μm，烤片≥2h（温度为58℃）。用二甲苯中做脱蜡处理2 次，每次10min，放入无水乙醇内5min，共2 次，干燥处理8min 左右。原位杂交仪内37℃胃酶工作液内消化切片≥0.5h。用PBS 溶液浸洗3 次，每次2min，脱水处理后，在空气内做干燥处理。加入EBER探针10μL，盖玻片后做封边处理，杂交处理3h 以上。完成杂交后，将橡胶水泥去除，用PBS 液浸泡，自然脱落盖玻片，再用PBS 液浸洗3 次，每次2min 滴加抗地高辛二抗，孵育0.5h以上，用PBS 液浸洗3 次，每次2min，显色后，做复染、脱水、透明、封片等处理，判定结果。

1.3 指标判定

本次检测均由我院2 名检验科专业且经验丰富的医生负责，EBER 阳性：信号显示在细胞核，且颜色为深棕色。

1.4 统计学方法

用统计学软件（SPSS13.0 版本）分析数据，χ2检验计数资料，表示为（%），t 检验计量资料，表示为（），若P＜0.05 则有统计学意义。

2 结果

90 例患者均接受改良EBER 原位杂交技术检测，21 例NBLA 患者中共3 例患者为阳性（14.29%），呈灶状、散在阳性。32 例NPC 患者中，均为阳性（100.00%）。22 例DLBCL患者中2 例患者为散在阳性（9.09%），15 例ENKL 患者中，均为强阳性（100.00%）。NBLA 阳性率14.29%低于NPC阳性率100.00%，DLBCL 阳性率9.09%低于ENKL 阳性率100.00%，数据差异较大（P＜0.05）。

3 讨论

EBV 编码的mRNA 则为EBER，高拷贝存在于感染EB 病毒后细胞核内。按照EBER RNA 探针，可将其用于细胞涂片、冷冻切片、石蜡切片，其灵敏度、特异性较高，此为临床测定EBV 的一项金标准，已在医学界得到广泛应用和一定认可。

改良EBER 原位杂交检测与常规杂交检测比较，杂交时间更短，由原来的16h 缩短为3h，操作步骤得到简化[2]。常规洗涤方式为58℃ TBS 液内洗涤，更改为常温PBS 液内洗涤则可。此次研究结果显示，NBLA 阳性率14.29%低于NPC 阳性率100.00%，DLBCL 阳性率9.09%低于ENKL 阳性率100.00%，数据差异较大（P＜0.05）。EBER 原位杂交技术检测NBLA 阳性，可推测存在潜在性EBV 感染，此为高危癌前病变，需密切监测并随访，以便早期确诊并治疗鼻咽癌。本研究中可能因流行病学、实验样本数量等因素影响，结果存在一定片面性，但结果与以往报告结果相符[3]，提示，改良EBER 原位杂交技术具有可靠性和稳定性。

改良EBER 原位杂交检测成功率高，稳定可靠，但多种因素会影响染色结果，如：①组织固定：离体组织需用中性缓冲甲醇4%充分固定，时间＞6h 则可，反之基因易降解，发生信号微弱或无杂交信号[4]。②预处理切片：用带正电荷且洁净度高的黏附玻片，厚度为3μm 或更薄，58℃环境下，至少烤2h，用新鲜无水乙醇和二甲苯脱蜡，并在空气中晾干后，再做消化处理，以降低假阴性。③胃酶消化：胃酶对靶核酸蛋白质有包围作用，组织通透性加大，探针渗透性增加，提升杂交成功率，此为检测是否成功的关键环节[5]。消化时间根据切片厚薄、固定时间、组织种类进行确定。所以，胃酶消化温度、时间的控制相当重要。反之也会发生假阴性状况。本研究内切片厚度为2～3μm，37℃环境下，切片时间均为0.5h 或以上，杂交成功[6]。④孵育杂交：将探针滴加厚，加盖玻片过程中，需注意勿产生气泡，并完好封边，让其在湿盒中平整放置进行杂交，控制杂交湿度和温度、杂交时间为3h 或以上，二抗也需在同等状况下进行孵育，反之会导致无杂交信号或减弱杂交信号，进而建议用自动原位杂交仪，确保条件稳定[7]。⑤严重控制质量和操作程序：实验过程中，操作人员需佩戴手套和口罩，准确配制PBS 液体，确保洗涤时间充足。建议实验由专业专人负责，监控质量，以确保实验结果稳定、理想。

文章来源：《中国耳鼻咽喉头颈外科》 网址: http://www.zgebyhtgwk.cn/qikandaodu/2021/0507/515.html